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ELISA小常識:
室內(nèi)質(zhì)量控制程序 臨床檢驗的檢測結(jié)果,每次或每天之間不可能沒有誤差。決定允許的誤差范圍,以臨床上不造成誤診與漏診為準,通過以下步驟來確定質(zhì)控范圍。1) 條件下的測定誤差。2) 已知值的血清在常規(guī)檢驗條件下的誤差。3) 未知值的血清在常規(guī)檢驗條件下的誤差。4) 臨床應用的要求。對任何一個試驗都應確定一個允許的誤差范圍,前題是滿足臨床要求。如允許誤差定得過小,在臨床上不存在任何意義,但為了符合該規(guī)定卻要花費很大人力、物力和時間。相反,如果將允許誤差定得過大,將使監(jiān)測系統(tǒng)察覺不到臨床上要求檢出的誤差,失去質(zhì)控的意義。
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人S100鈣結(jié)合蛋白A7/鈣粒蛋白A(S100A7)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)
試劑盒使用說明書
本試劑僅供研究使用 目的:本試劑盒用于測定人血清,血漿及相關(guān)液體樣本中S100鈣結(jié)合蛋白A7/鈣粒蛋白A(S100A7)的含量。
實驗原理:
本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人S100鈣結(jié)合蛋白A7/鈣粒蛋白A(S100A7)水平。用純化的人S100鈣結(jié)合蛋白A7/鈣粒蛋白A(S100A7)抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入S100鈣結(jié)合蛋白A7/鈣粒蛋白A(S100A7),再與HRP標記的S100鈣結(jié)合蛋白A7/鈣粒蛋白A(S100A7)抗體結(jié)合,形成抗體-抗原-酶標抗體復合物,經(jīng)過洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的S100鈣結(jié)合蛋白A7/鈣粒蛋白A(S100A7)呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),通過標準曲線計算樣品中人S100鈣結(jié)合蛋白A7/鈣粒蛋白A(S100A7)濃度。
試劑盒組成:
(20ml×20倍)×1瓶 |
樣本處理及要求:
1. 血清:室溫血液自然凝固10-20分鐘,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清,保存過程中如出現(xiàn)沉淀,應再次離心。
2. 血漿:應根據(jù)標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,混合10-20分鐘后,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應該再次離心。
3. 尿液:用無菌管收集,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
4. 細胞培養(yǎng)上清:檢測分泌性的成份時,用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時,用PBS(PH7.2-7.4)稀釋細胞懸液,細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融,以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。
5. 組織標本:切割標本后,稱取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆。標本融化后仍然保?/span>2-8℃的溫度。加入一定量的PBS(PH7.4),用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清。分裝后一份待檢測,其余冷凍備用。
6. 標本采集后盡早進行提取,提取按相關(guān)文獻進行,提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗,可將標本放于-20℃保存,但應避免反復凍融.
7. 不能檢測含NaN3的樣品,因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。
操作步驟
1. 標準品的稀釋與加樣:在酶標包被板上設標準品孔10孔,在、第二孔中分別加標準品100μl,然后在、第二孔中加標準品稀釋液50μl,混勻;然后從孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔,再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μl,混勻;然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉,再各取50μl分別加到第五、第六孔中,再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul,混勻;混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl,混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中,再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl,混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。(稀釋后各孔加樣量都為50μl,濃度分別為72ng/ml,48 ng/ml ,24 ng/ml,12ng/ml, 6ng/ml)。
2. 加樣:分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑,其余各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,然后再加待測樣品10μl(樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。
3. 溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
4. 配液:將30(48T的20倍)倍濃縮洗滌液用蒸餾水30(48T的20倍)倍稀釋后備用。
5. 洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復5次,拍干。
6. 加酶:每孔加入酶標試劑50μl,空白孔除外。
7. 溫育:操作同3。
8. 洗滌:操作同5。
9. 顯色:每孔先加入顯色劑A50μl,再加入顯色劑B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色15分鐘.
10. 終止:每孔加終止液50μl,終止反應(此時藍色立轉(zhuǎn)黃色)。
11. 測定:以空白空調(diào)零,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。 測定應在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。
注意事項:
1. 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,酶標包被板開封后如未用完,板條應裝入密封袋中保存。
2. 濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶,洗滌時不影響結(jié)果。
3. 各步加樣均應使用加樣器,并經(jīng)常校對其性,以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi),如標本數(shù)量多,推薦使用排槍加樣。
4. 請每次測定的同時做標準曲線,做復孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高(樣本OD值大于標準品孔孔的OD值),請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)(n倍)后再測定,計算時請乘以總稀釋倍數(shù)(×n×5)。
5. 封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。
6. 底物請避光保存。
7. 嚴格按照說明書的操作進行,試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.
8. 所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
9. 本試劑不同批號組分不得混用。
10. 如與英文說明書有異,以英文說明書為準。
計算:
以標準物的濃度為橫坐標,OD值為縱坐標,
在坐標紙上繪出標準曲線,根據(jù)樣品的OD
值由標準曲線查出相應的濃度;再乘以稀釋
倍數(shù);或用標準物的濃度與OD值計算出標
準曲線的直線回歸方程式,將樣品的OD值
代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋
倍數(shù),即為樣品的實際濃度。
(此圖僅供參考)
試劑盒性能:
1.樣品線性回歸與預期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.92以上。
2.批內(nèi)與批見應分別小于9%和15%
檢測范圍:
2ng/ml -90 ng/ml
保存條件及期:
1.試劑盒保存:;2-8℃。
2.期:6個月
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英文名稱:Chicken Tumor necrosis factor α,TNF-α ELISA KIT
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產(chǎn)品規(guī)格:48T/96T實驗樣本:血清、血漿、細胞上清液、組織等。
檢測種屬:人、大小鼠、兔子等
保存條件:2~8℃,有效期6個月。
研究領域:炎癥研究、神經(jīng)生物學、新陳代謝、信號通路、免疫學、傳染病、其他研究。
供應貨期:現(xiàn)貨
產(chǎn)品特點:經(jīng)測定,試劑盒在有效期內(nèi)按推薦溫度保存,其活性降低率小于5%。為減小外部因素對試劑盒破壞前后檢測值的影響,實驗室的環(huán)境條件需盡量保持一致,尤其是實驗室內(nèi)溫度、濕度及溫育條件。其次由同一實驗員來進行操作可減少人為誤差。
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